Molekularbiologische Untersuchungen von Nadelbaeumen, die kontrollierten Umwelteinfluessen ausgesetzt sind. Abschlussbericht des Forschungsvorhabens

1992

39 S.

62 Lit. Ang.

Bandaufführung

60033

Ziel des Forschungsprojektes ist es, Veraenderungen im RNA-Metabolismus geschaedigter Baeume mit molekularbiologischen und gentechnischen Methoden zu erfassen und diese Veraenderungen, wenn moeglich, definierten Schadstoffen, z.B. O3, zuzuordnen. Untersuchungsobjekt ist die Rotfichte (Picea abies (L.) Karst.). Die Nadelproben stammen von geschaedigten und symptomlosen Baeumen aus dem Freiland, aus OPEN TOP-Kammern und aus geschlossenen Begasungskammern. Neben der Methode der zweidimensionalen Gelelektrophorese, mit der niedermolekular RNAs, z.B. die RNA450, untersucht wurden, konnten in zunehmendem Mass gentechnische Methoden eingesetzt werden, um Veraenderungen von hochmolekularen RNAs, z.B. von mRNAs, zu erfassen. Fuer Fichte (Picea abies L., Karst) wurde eine cDNA-Bank hergestellt, um darin Klone von solchen mRNA-Spezies zu identifizieren, deren Konzentrationen sich in Abhaengigkeit bzw. in Korrelation mit dem Schadbild signifikant aendern. Zunaechst wurde ein Verfahren entwickelt, um aus Nadeln von Fichte polyA+-RNA genuegender Reinheit fuer Gelelektrophorese, Hybridisierung und, was am wichtigesten war, fuer reverse Transkription und die anschliessenden Klonierungsschritte zu gewinnen. Die RNA aus symptomloser und geschaedigter Fichte wurde gemischt und diente als Ausgangsmaterial zur Herstellung der cDNA-Bank im Phagen Lambdagt10. Schadensassoziierte Klone wurden in drei verschiedenen Screening-Ansaetzen gesucht. In der ersten Serie wurden radioaktiv markierte Sonden von der mRNA eines symptomlosen Baumes und eines geschaedigten hergestellt und damit insgesamt 10 000 Klone auf unterschiedlich intensiv Hybridisierungssignale hin getestet. 37 Klone mit unterschiedlichen Hybridisierungsintensitaeten wurden gefunden. In einer zweiten Serie wurden die Sonden von einem einzigen symptomlosen und einem einzigen geschaedigten Baum, aber aus drei verschiedenen Jahreszeiten (Juli, September und Dezember), praepariert, um den Einfluss der Jahreszeit zu analysieren. Mit diesen insgesamt sechs verschiedenen mRNA-Praeparationen wurden 2000 Klonen getestet. Fuenf von den 2000 Klonen zeigten deutlich unterschiedliche Hybridisierungsintensitaet mit in etwa gleichem Ausmass im Juli, September und Dezember. Die dritte Screening-Serie diente der Unterscheidung von echter Schadenskorrelation und der Korrelation mit zufaelliger genetischer Variation. Dazu wurden zwei mRNA- Praeparationen hergestellt, in einem Fall aus einer Mischung von 10 symptomlosen, im anderen Fall aus 10 geschaedigten Baeumen. Mit diesen Mischsonden wurden sechs schadensassoziierte Klone identifiziert. Durch Sequenzanalyse und Homologieuntersuche konnten zwei dieser Klone eindeutig identifiziert werden: ein Klon kodiert fuer die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase (rbcS), der andere fuer die Untereinheit II aus dem Photosystem I. In beiden Faellen konnte in ...