Direct genotyping of the poplar leaf rust fungus, Melampsora medusae f. sp. deltoidae, using codominant PCR-SSCP markers

Berlin

2005

S. 245-261

3 Abb., 46 Lit. Ang.

Artikel aus einer ZeitschriftUnselbständiges Werk

200125316

Zum Nachweis von Polymorphismen bei Melampsora medusae f. sp. deltoidae wurden zwei anonyme DNA Marker aus einer SSCP-Analyse entwickelt. Zunächst wurden Isolate aus einzelnen Uredinien gewonnen, die DNA wurde aus den Uredosporen extrahiert und polymorphe RAPD Amplifikationsprodukte von acht Mono-Uredinium-Isolaten wurden auf einem SSCP-Gel getrennt, um Unterschiede zwischen ihnen nachzuweisen. Banden, die bei den acht geprüften Isolaten mögliche polymorphe Loci darstellten, wurden aus dem SSCP-Gel ausgeschnitten und mit PCR reamplifiziert, dann geklont und sequenziert. Für zwei von insgesamt drei sequenzierten DNA-Fragmenten wurde ein Primerpaar entwickelt, um ein in der Grösse für die SSCP-Analyse (<600 bp) geeignetes DNA-Fragment zu amplifizieren. Jedes Primerpaar amplifizierte bei allen acht ursprünglich für ihre Entwicklung verwendeten Isolaten ein PCR-Produkt, und diese wurden anschliessend mit SSCP analysiert. Für beide putativen Loci wurden bei den Isolaten Polymorphismen festgestellt. Die beiden Primerpaare amplifizierten ein PCR-Produkt der erwarteten Grösse bei allen 32 zusätzlich geprüften Mono-Uredinium-Isolaten des Pilzes. Bei den insgesamt 40 geprüften Mono-Uredinium-Isolaten wurden für die Loci A und B 5 bzw. 11 Allele gefunden, und 12 bzw. 34 Isolate erwiesen sich als heterozygot, was durch mehr als zwei Banden auf den SSCP-Gelen angezeigt wurde. Die Spezifität der Primerpaare wurden mit 106 Pilzisolaten aus verschiedenen Taxa geprüft, darunter andere Roste sowie DNA aus gesunden Pappelblättern aus Gewächshauskulturen. DNA-Amplifikationsprodukte der erwarteten Grösse wurden nur erhalten, wenn DNA von Melampsora medusae f. sp. deltoidae präsent war. Die PCR-Amplifikations-Bedingungen mit diesen beiden Primerpaaren wurde so optimiert, dass ein Genotyping direkt bei einzelnen von infizierten Blättern entnommenen Uredinien erfolgen kann und somit eine Pilzkultur zur Charakterisierung von Individuen entfällt. Dies ermöglicht grosse Probenzahlen in Populationsstudien.