Differentielles Screening in einer cDNA-Bank von Fichte nach Waldschaden-assoziierten Klonen ergibt die Akkumulation der mRNA der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase

1993

S. 317-343

78 Lit. Ang.

Unselbständiges Werk

200092900

Fuer Fichte (Picea abies L., Karst) wurde eine cDNA-Bank hergestellt, um darin Klone von solchen mRNA-Spezies zu identifizieren, deren Konzentrationen sich in Abhaengigkeit bzw. in Korrelation mit dem Schadbild signifikant aendern. Zunaechst wurde ein Verfahren entwickelt, um aus Nadeln von Fichte polyA+-RNA genuegender Reinheit fuer Gelelektrophorese, Hybridisierung und, was am wichtigsten war, fuer reverse Transkription und die anschliessenden Klonierungsschritte zu gewinnen. Die RNA aus symptomloser und geschaedigter Fichte wurde gemischt und diente als Ausgangsmaterial zur Herstellung der cDNA-Bank im Phagen Lamda gt 10. Schadensassoziierte Klone wurden in drei verschiedenen Screening-Ansaetzen gesucht. In der ersten Serie wurden radioaktiv markierte Proben von der mRNA eines symptomlosen Baumes und eines geschaedigten Baumes hergestellt und damit insgesamt 10 000 KLone auf unterschiedlich intensive Hybridisierungssignale hin getestet. 37 Klone mit unterschiedlichen Hygridisierungsintensitaeten wurden gefunden. In einer zweiten Serie wurden die Proben von einem einzigen symptomlosen und einem einzigen geschaedigten Baum, aber aus drei verschiedenen Jahreszeiten (Juli, September und Dezember) praepariert, um den Einfluss der Jahreszeit zu analysieren. Mit diesen insgesamt sechs verschiedenen mRNA-Praeparationen wurden 2000 Klone getestet. Fuenf von den 2000 Klonen zeigten deutlich unterschiedliche Hybridisierungsintensitaet mit in etwa gleichem Ausmass im Juli, September und Dezember. Die dritte Screening-Serie diente der Unterscheidung von echter Schadenskorrelation und der Korrelation mit zufaelliger genetischer Variation. Dazu wurden zwei mRNA-Praeparationen hergestellt, in einem Fall aus einer Mischung von 10 symptomlosen, im anderen Fall aus 10 geschaedigten Baeumen. Mit diesen Mischproben wurden sechs schadensassoziierte Klone identifiziert. Durch Sequenzanalyse und Homologiesuche konnten zwei dieser Klone eindeutig identifiziert werden: ein Klon kodiert fuer die kleine Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase (Rubisco SS), der andere fuer die Untereinheit II aus dem Photosystem I. Im Falle der Ribulosebisphosphat Carboxylase konnte in Northernhybridisierungen ein Anstieg der mRNA-Konzentration um den Faktor drei ermittelt werden. dies wird als Erhoehung des Proteinumsatzes in geschaedigten Fichten diskutiert, da die Enzymaktivitaet unter vergleichbaren Bedingungen nicht ansteigt (WEIDNER und KRAUS 1987, Physiol. Plantarum 70,664-672) oder sogar geschwaecht ist waehrend die Gesamtkonzentration gleich bleibt (SCHMIEDEN- KOMPALLA et al. 1989, Photosynth. Res. 21, 161-169). Die Ergebnisse zeigen, dass die Methoden der Klonierung und des differentiellen Screenings auch auf ein bezueglich RNA-Praeparation ausserordentlich schwieriges System wie Fichte angewendet werden koennen und schadensassoziierte Klone in der Tat identi.....