Abschlussbericht zum Forschungsvorhaben Nachweis, Charakterisierung, Lokalisation und Aktivitaetsverlauf von Oxidasen und Oxigenasen in Koniferen unter dem Einfluss von Luftschadstoffen. Teilprojekt B/ Untersuchungen ueber membran.....; .

1993

S. 50-77

33 Lit. Ang.

Unselbständiges Werk

200060193

Die Messung von Zimtsaeure-4-Hydroxylase mit Mikrosomen aus Fichtennadeln nach Standardverfahren gelang nicht. Daher wurde ein grundlegend neues Aufarbeitungs- und Messprotokoll entwickelt, mit dem die Zimtsaeure-4- Hydroxylase Aktivitaet aus P. abies Zellsuspensionskulturen mittels HPLC auch ohne Zuhilfenahme von radioaktiv markiertem Substrat gemessen werden kann. Die Reaktion der Zimtsaeure-4-Hydroxylase konnte in allen wichtigen Punkten charakterisiert werden. Das Enzym is membrangebunden und strikt NADPH-abhaengig, andere reduzierte Nukleotidkofaktoren zeigen keine Wirkung. Fuer einen Umsatz wird molekularer Sauerstoff benoetigt, N2 oder CO hemmen die Aktivitaet des Enzyms. Ein wichtiger Punkt in der Charakterisierung ist die hohe Empfindlichkeit des Enzyms gegenueber Detergenzien. Durch Zugabe einer NADPH: Cytochrom P450-Reduktase-haltigen Fraktion kann die Aktivitaet gesteigert werden. Durch die Bestimmung eines optimalen Konzentrationsverhaeltnisses von Detergenz zu einem phenolbindenden Polymer konnte die enzymatische Messung von membrangebundenen Enzymkomplexen aus phenolreichen Pflanzengeweben moeglich gemacht werden. Es wurde ein Fermentationssystem fuer P. abies Zellsuspensionskulturen entwickelt. Die Ergebnisse zur Charakterisierung der Enzymreaktion aus dem Zellkultursystem konnten auf die Fichtennadeln uebertragen werden. Es wurden die Grundlagen einer Strategie entwickelt, um die Zimtsaeure-4-Hydroxylase aus Zellsuspensionskulturen mittel FPLC zu reinigen. Dieses Verfahren erlaubt die Bestimmung der enzymatischen Aktivitaet im solubilisierten Zustand, ohne dass eine funktionelle Komplexbildung von Hydroxylase und Reduktase erfolgen muss. Darueber hinaus sollte diese Methode eine schnelle und effiziente Analyse des Cytochrom P450-Isoenzymmusters in Nadeln und Zellsuspensionskulturen ermoeglichen.