Schadensassoziierte Klone in einer cDNA Bank von Fichte. Molekularbiologische Untersuchungen von Nadelbaeumen, die kontrollierten Umwelteinfluessen ausgesetzt sind Luftverunreinigungen und Waldschaeden : Duesseldorf : Deutschland

1991

S. 20.1-20.24

8 Abb., 22 Lit. Ang.

Unselbständiges Werk

200059787

Fuer Fichte wurde eine cDNA-Bank hergestellt, um darin Klone von solchen mRNA-Spezies zu identifizieren, deren Konzentrationen sich in Abhaengigkeit bzw. in Korrelation mit dem Schadbild signifikant aendern. Zunaechst wurde ein Verfahren entwickelt, um aus Nadeln von Fichte polyA+-RNA genuegender Reinheit fuer Gelelektrophorese, Hybridisierung und, was am wichtigsten ist, fuer reverse Transkription und die anschliessenden Klonierungsschritte zu gewinnen. Die RNA aus symptomloser und geschaedigter Fichte wurde gemischt und diente als Ausgangsmaterial zur Herstellung der cDNA-Bank im Phagen Lambda gt10. Aus 50g Nadelmaterial wurden 20Myg polyA+-RNA erhalten; ein Aliquot von 30 ng polyA+-RNA reichte zur Herstellung von 2 x 10 hoch 5 rekombinanten Phagen. Die Insertionslaengen betrugen zwischen 150 und 1600 Basenpaaren. Schadensassoziierte Klone wurden in drei verschiedenen Screening-Ansaetzen gesucht. In der ersten Serie wurden radioaktiv markierte Sonden von der mRNA eines symptomlosen und eines geschaedigten Baumes hergestellt und damit insgesamt 10000 Klone auf unterschiedlich intensive Hybridisierungssignale hin getestet. 37 Klone mit unterschiedlichen Hybridisierungsintensitaet wurden gefunden. In einer anderen Serie wurden die Sonden auch von einem einzelnen symptomlosen und einem einzelnen geschaedigten Baum, aber zu drei verschiedenen Zeiten (Juli, September und Dezember) hergestellt, um den Einfluss der Jahreszeit festzustellen. Mit diesen insgesamt sechs verschiedenen Sonden wurden 2000 Klone getestet. Insgesamt fuenf von den 2000 Klonen zeigten deutlich unterschiedliche Hybridisierungsintensitaet etwa gleichen Ausmasses in Juli, September und Dezember. Die dritte Screening-Serie diente der Unterscheidung von echter Schadenskorrelation und der Korrelation mit zufaelliger genetischer Variation. Dazu wurden zwei Sonden hergestellt, in einem Fall aus einer Mischung von 10 symptomlosen, im anderen Fall aus 10 geschaedigten Baeumen. Mit diesen Mischsonden wurden sechs schadensassoziierte Klone identifiziert. Einer der Klone diente als Sonde, um die 20 Einzelbaeume zu pruefen. Das Ergebnis, das zuvor an beiden Ensembles von je 10 Baeumen erhalten worden war, konnte an den Einzelbaeumen weitgehend bestaetigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Methoden der Klonierung und des differentiellen Screenings auch auf ein bezueglich RNA-Praeparation ausserordentlich schwieriges System wie Fichte angewendet und schadensassoziierte Klone in der Tat identifiziert werden koennen. Die Bedeutung solcher schadensassoziierter Klone fuer die Untersuchung der pathogenen Mechanismen und fuer die Diagnostik wird diskutiert.