Herstellung eines polyklonalen Antikörpers für Phellinus pini und Prüfung seiner diagnostischen Verwendbarkeit

Production of a polyclonal antibody to Phellinus pini and examination of its potential use in diagnostic assays

1999

19 Lit. Ang.

Unselbständiges Werk

8320

200082569

Zur Unterscheidung zwishcen Phellinus pini, Inonotus tomentosus und Inonotus circinatus wurde ein polyklonaler Antikörper gegen den N-terminalen Teil eines 25-kDa Proteins hergestellt, das für P. pini spezifisch ist. Die Eignung dieses polyklonalen Antikörpers gegen ein synthetisches N-terminales Peptid von diesem Protein wurde mittels Western-Blot, indirekt ELISA und Hemmungs-ELISA-Techniken überprüft. Mit Hilfe von HPLC mit Phasenumkehr wurde festgestellt, dass das als Immunogen dienende synthetische N-terminale Peptid zu über 80% rein war. Nach der Immunisierung wurden zu drei verschiedenen Zeitpunkten Antiseren gewonnen. Die Antikörper wurden aus dem rohen Antiserum mittels Immunoaffinitäts-Gelchromatographie gereinigt. Nach eindimensionaler SDS-PAGE ergab sich mittels Western-Immunoblot, dass der polyklonale Antikörper I von P. pini das Immunogen (25 kDa-Protein) - von einer einzigen Ausnahme abgesehen - in allen P. pini-Isolaten nachwies, aber in keinem der Isolate von I. tomentosus und I. circinatus. Trotzdem stellten Kreuzreaktionen ein Problem dar, weil der polyklonale P. pini Antikörper I bei fast allen Isolaten der anderen Arten auch mit Banden von anderem Molekulargewicht reagierte. mit dem indirekten ELISA-Nachweis tendierten die P. pini-Isolate zu einer höheren Affinität mit dem polyklonalen Antikörper als die Nicht-Zielarten, aber es trat doch eine gewisse Kreuzreaktion auf. mit dem Hemmungs-ELISA-Test, der mit unterschiedlichen Antigen-Konzentrationen durchgeführt wurde (1,56-400 ng/100 öl) konnten P. pini und die beiden Inonotus-Arten nicht klar unterschieden werden. Die beim I. tomentosus-Isolat 52 festgestellt geringe Kreuzreaktivität (9%) wurde auch im indirekten ELISA-Test beobachtet. Das P. pini-Isolat 41 zeigte in allen drei Testverfahren die höchste antigene Wirkung. Trotz der Kruezreaktivität ist der Antikörper in Western-Blots für die Diagnose der meisten P. pini-Isolate geeignet.