Study of gene regulation and function of monoterpene synthases in Holm oak (Quercus ilex L.) and transgenic birch (Betula pendula Roth) : Inaugural-Dissertation, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Fakultät für Forst- und Umweltwissenschaften
Fluchtige organische Verbindungen (VOC) werden neben anderen Quellen auch von Pflanzen emittiert und spielen eine wichtige Rolle in der Atmospharenchemie. Das Hemiterpen Isopren (C5) ist das wichtigste der von Pflanzen emittierten fluchtigen organischen Verbindungen gefolgt von den Monoterpenen (C10) dessen Emissionen jahrlich bis zu 250 Tg C y-1 betragen. Einige Arten speichern Monoterpene in speziellen Strukturen (Koniferen, Lamiancaen), andere Pflanzen wie die Steineiche (Quercus ilex L.) haben dagegen keine speziellen Strukturen zur Speicherung der synthetisierten Monoterpene. Bei diesen Arten ist die die Monoterpensynthese Licht abhängig und durch die Verwendung des fixierten Kohlenstoffs und der Energie/Redox-Aquivalente eng mit der photosynthetischen Aktivitat verbunden. Modelle zur Vorhersage von pflanzlichen Terpenemissionen wurden an Genauigkeit gewinnen, wenn weitere Faktoren, die die Emissionen beeinflussen, entratselt wurden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war Monoterpensynthasen aus Blättern der hartblattrigen immergrünen Steineiche zu isolieren und zu charakterisieren. 24 cDNAs wurden durch RFLP analisiert und Gemas ihres Fragmentierungsmusters klassifiziert. Zwei Klone wurden schlieslich isoliert und heterogen in E. coli exprimiert. Eines dieser Gene kodiert eine bisher unbekannte Multiprodukt-Monoterpen.Synthase, die die Bildung von ı¿-Pinen (41.2 %), Sabinen (34.3 %) und s-Pinen (24.5 %) katalysiert. Aufgrund seines Hauptproduktes wurde diesem Monoterpensynthasegen der Name QiPINS gegeben und die komplette Sequenz bei EMBL unter der Nummer AM283099 eingereicht. Entsprechend seiner Sequenz wurde das QiPINS Gen in die Unterfamilie Tpsb eingeteilt (Bohlmann et al., 1998). Das Enzymprotein enthalt die bei den meisten Monoterpenen-Sysnthasen vorhandenen Regionen, namlich (i) eine Doppel-Arginingruppe am N-Ende (RRX8W) des funktionellen Proteins und (ii) das an Aspartat reiche Motif (DDXXD) im enzymatischen Reaktionszentrum. Die QiPINS zeigte die hochste Enzymaktivitat bei neutralen pH Bedingungen und einer Temperatur von 35 œŘC. Fur das Substrat Geranyldiphosphat konnten apparente Michaelis-Konstanten (Km.Werte) zwischen 138.1 und 270.8 ıÊM in Abhangigkeit des betrachteten Monoterpenprodukts bestimmt werden.Die Aktivität der QiPINS ist abhängig von Mg2+ und wurde nicht durch die Zugabe von verschiedenen Kationen und deren Kombination beeinflusst (Mn2+, MoO42-, K+). Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Transformation der, in geringem Maße Monoterpene emittierenden, Birke (Betula pendula Roth) mit dem aus der Steineiche stammenden Myrcensynthase (QiMYRS) Gen um die biologische Funktion(en) von Monoterpenen in nicht Monoterpen-speichernden Pflanzen zu studieren. Zu diesem Zweck wurden zwei Genkonstrukte mit der QiMYRS (myrc01 und myrc02) hergestellt und für zwei verschiedene Transformationen verwendet. Der einzige Unterschied zwischen den beiden Genkonstrukten bestand darin, dass, dass das erste Konstrukt einen aus 6 Histidinen bestehenden his-tag am C-terminalen Ende des Proteins besaß, wärend im zweiten Konztrukt dieser Bereich durch zwei Stop-Kodon ersetzt war. Die Transfomationseffizienz von Birkenblättern aus Sprosskulturen betrug bei der ersten Transformation 4 % und bei der zweiten 2 %. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurden die erhaltenen transgenen Linien auf DNA und RNA Ebene hinsichtlich Einbau und Expression der QiMYRS getestet. Trotz erfolgreicher Transformation in das Birkengenom konnte auf RNA-Ebene keine Transkription des QiMYRS-Gens in den transgenen Linien festgestellt, obwohl die Transkription des Selektionsmarkers (nptll Gen) vorhanden war, was auf eine Inaktivität der QiMYRS hinweist. Zwei mögliche Gründe für die Inaktivität des Gens werden diskutiert, zum Einen die Inaktivierung durch eine mögliche Methylation des benutzten 35S Promoters oder des Hauptenzyms und zum Anderen eine mit dem N-Terminal-Transit-Peptid (aus der Birke stammened) oder dem His-tag verbundene Störung der Genexpression. Aufgrund dieser Beobachtung konnten auch keine erhöhten Monoterpenemissionen der transgenen Linien bei Emissionsmessungen mit einem Protonen-Transfer-Reaktions-Massenspektrometer (PTR-MS) festgestellt werden.
Der dritte Teil der Arbeit befasste sich mit der Regulation und Emission der lichtabhängigen von Monoterpenenemission der Steineiche unter dem Einfluss von mechanischer Verwundung und simuliertem Herbivorenfraß, um den Einfluß dieser Stresssituation auf die lichtabhängige Monoterpenbiosynthese zu untersuchen. Verschiedene Experimente wurden unter kontrollierten Laborbedingungen, im Treibhaus und im Freiland durchgeführt um den Einfluss von Methyljasmonat (MeJA), einem wichtigen Botenstoff; und mechanischer Verletzung auf die Gen-Expression, die Monoterpensynthaseaktivität und die Monoterpengehalte bzw. Emissionen zu ermitteln. Zur Analyse von endogenen, in den Membranen gelösten, Monoterpenen aus Steineichenblättern wurde eine neue Extraktionsmethode entwickelt und für die Bestimmung der blattinternen Konzentrationen nach der Behandlung angewandt. Dabei zeigte sich bei denTreibhausversuchen, dass die Genexpression, die Monoterpenesynthase-Aktivitaten und die Monoterpengehalte keiner Tag . Nacht Rhythmik unterlagen und auch nicht durch eine Behandlung mit 100 ıÊM MeJA beeinflusst wurden. In Laborexperimenten unter kontrollierten Bedingungen konnte gezeigt werden, das die Monoterpenemissionen der mit 100 ıÊM MeJA behandelten Steineichenblatter nach 24 und 48h gegenuber den Kontrollpflanzen leicht jedoch nicht signifikant erhoht wurden. Ziel eines abschliesenden Feldexperiments war es den Einflus von MeJA auf die Aktivitat von Monoterpensynthasen in Steineichenblattern und Fichtennadeln vergleichend zu untersuchen. Die Behandlung mit 10 mM MeJA fuhrte in den Fichtennadeln zur Induktion einer neuen Enzymaktivitat (Delta-3-Caren) wohingegen die Behandlung mit 100 ıÊM keinen Einflus auf die Monoterpensynthaseaktivitaten in den Nadeln hatte. Die Behandlung von Steineichenblattern mit 10 mM MeJA fuhrte im Gegensatz zu der Fichte zu einer Repression der Monoterpensynthaseaktivitaten wahrend die Behandlung mit 100 ıÊM MeJA auf der Transkriptebene zu einer deutlichen transienten Erhohung der Genkopien fuhrte, was sich aber letztendlich nicht in einer Erhohung der Monoterpensynthaseaktivitaten in den Steineichenblattern ausdruckte. Die Daten weisen insgesamt darauf hin,, dass die sich die Regulation der Monoterpenbiosynthese in Koniferennadeln, wie von der Fichte, und zwischen Pflanzen die eine stark lichtabhangige, an die Photosynthese gekoppelte Monoterpenemission besitzen grundlegend unterscheidet. Auf der einen Seite scheinen Monoterpenemissionen in nicht speichernden Blattern der Steineiche vor oxidativen und Hitzestress zu schutzen. Auf der anderen Seite kann Herbivorenfras die Synthese und Emission von verschiedenen (Mono)Terpenen, die Pradatoren der Herbivoren anlocken oder die Herbivoren selbst abschrecken, induzieren.
