Erzeugung und Transformation haploider regenerativer Kallusse bei Populus nigra (L.) x hybrida : Dissertation, Universität Hamburg, Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
In der funktionellen Genomforschung ist die Erzeugung von Knockout-Mutanten ein gängiger Ansatz, um Gene zu isolieren und zu charakterisieren. Die hierfür verwendeten Systeme TDNA-Tagging und Transposon-Tagging können durch die Insertion einer T-DNA oder eines Transposons in ein Gen dessen Expression stören. Eine anschließende Selbstung hat zum Ziel, in einigen Nachkommen den homozygoten Zustand des defekten Allels zu erreichen und einen darauf basierenden veränderten Phänotyp hervorzubringen, was als Insertionsmutation oder Knockout-Mutation bezeichnet wird. In der Gattung Populus, einem Modellbaumsystem, kann eine Selbstung nicht durchgeführt werden, weil Pappeln diözisch sind. Folglich ist eine Homozygotie eines defekten Gens nicht auf diesem Wege möglich. Die Haploidisierung der Pappel stellt einen Lösungsansatz für die fehlende Homozygotie dar. Im haploiden Genom kann eine Insertion direkt eine Knockout-Mutation bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurde in den Jahren 2001 und 2002 eine Pollenkultur einer Schwarzpappelhybride etabliert, die regenerierbares haploides und doppelhaploides Pappelgewebe erzeugte. Aus sieben haploiden Kalluslinien regenerierten in-vitro-Pflanzen. Von drei Linien wurden erfolgreich diploidisierte Pflanzen in Erde überführt. Haploide Pflanzen entwickelten sich nach der Bildung weniger Blätter nicht weiter. Zudem wurde der haploide Ursprung diploider und tetraploider Kalluslinien mittels Mikrosatelliten überprüft. Die Donorbäume dienten als heterozygote Kontrollen. Bei 60 von 66 regenerierten Kallussen (91%) wurde eine somatische Regeneration ausgeschlossen und bei 57 (86%) ein haploider Ursprung angenommen. Ferner wurde die Transformierbarkeit haploider Gewebe mit anschließender haploider Regeneration nachgewiesen. Ein Agrobacterium-vermittelter Transfer des Genkonstruktes 35S-Ac-rolC bei den haploiden Linien M22-1c5 und FD25 erzeugte mindestens 10 transgene regenerative Kalluslinien, unter ihnen vier haploide, von denen auch Pflanzen in Erde überführt werden konnten. PCR-Analysen bestätigten die Transposition des Ac-Elementes. Mit dem hier erarbeiteten Protokoll für ein in vitro-Regenerationssystem aus isolierten unreifen Pollen wird dem Modellbaumsystem Populus eine vielversprechende Alternative in der Erzeugung haploider und doppelhaploider Gewebe und Pflanzen angeboten.
